Enfoque metagenómico para la caracterización del microbioma de aves corral. Revisión / Metagenomic approaches for characterization of poultry microbiome. A review

RESUMEN El pollo y el huevo son una fuente importante de proteína para el ser humano a nivel mundial. La producción de estos alimentos se ha intensificado durante los últimos años y se prevé que se produzca alrededor de 1 50 millones de toneladas de carne de pollo en 2020 (OCDE / FAO, 2018). Sin embargo, uno de los mayores problemas ligados a los procesos de producción avícola lo constituyen las enfermedades infecciosas ocasionadas por microorganismos patógenos. Entre los más relevantes se encuentran microorganismos como Salmonella ssp, Campylobacter spp, y Escherichia coli. Por lo tanto, es importante comprender los mecanismos implicados en la colonización de microorganismos patógenos que afectan a las aves de corral y sus interacciones con la microbiota gastrointestinal las cuales son clave en la mejora de la absorción de nutrientes y el fortalecimiento del sistema inmune, que influye en el crecimiento, el bienestar y la salud de las aves de corral. Sin embargo, hay poca información relacionada con la microbiota gastrointestinal de pollos parrilleros y gallinas productoras de huevo. Hasta hace poco, la caracterización se limitaba a los microorganismos que podían recuperarse a través de cultivos tradicionales. Por lo anterior, en el último tiempo se ha intensificado el uso de técnicas moleculares, entre las que se destaca la metagenómica, la cual ofrece una alternativa para una mejor comprensión de las interacciones bacterianas, la identificación de genes de resistencia a los antibióticos, identificación de elementos genéticos móviles, y el diseño de estrategias para intervenciones más efectivas con el objetivo de romper la cadena de transmisión de microorganismos patógenos durante el ciclo de producción avícola. En esta revisión, se describen los principales enfoques metagenómicos para el estudio de microbiomas de aves de corral, las técnicas de secuenciación y herramientas bioinformáticas usadas para su caracterización.

ABSTRACT Chicken and eggs are an important source of protein for humans worldwide. Production of these foods has been intensified in recent years and around 150 million tonnes of chicken meat is expected to be produced by 2020 (OECD / FAO, 2018). However, one of the biggest problems linked to poultry production processes are the infectious diseases caused by pathogenic microorganisms. Among the most relevant are found microorganisms such as Salmonella ssp, Campylobacter spp, and Escherichia coli. Therefore, it is important to understand the mechanisms involved in the colonization of pathogenic microorganisms that can affect poultry and their interactions with the gastrointestinal microbiota, which are key in improving nutrient absorption and strengthening the immune system, which it influences the growth, welfare and health of the chicken. However, there is little information related to the gastrointestinal microbiota of chicken. Until recently, the characterization was limited to microorganisms that could be recovered through culture traditional. Therefore, in the last time, it has been intensified use of molecular techniques, among those is remarked metagenomics, which offers an alternative for a better understanding of bacterial interactions, the identification of antibiotic resistance genes, identification of mobile genetic elements, and the design of strategies for more effective interventions with the aim of breaking the chain of transmission of pathogenic microorganisms during the poultry production cycle. In this review, the main metagenomics approaches are describe aimed to study microbiomes from poultry, sequencing techniques and bioinformatics tools used for its characterization.

Balance de Flujos Metabólicos en Saccharomyces cerevisiae basado en Compartimentalización Intracelular / Metabolic Flows Balance in Saccharomyces cerevisiae based on Intracellular Compartmentalization

Una de las técnicas más utilizadas para la predicción de producción de bioproductos y distribución intracelular de flujos de microorganismos es el Análisis de Balance de Flujos - FBA por sus siglas en inglés. El FBA requiere de una función objetivo que represente el objetivo biológico del microorganismo estudiado. En este trabajo se propone un nuevo tipo de funciones objetivo basada en la combinación de objetivos de compartimentos físicos presentes en el microorganismo estudiado. Este tipo de funciones objetivo son examinadas junto con un modelo estequiométrico extraído de la reconstrucción iMM904 del microorganismo S. cerevisiae. Su desempeño se compara con la función objetivo más usada en la literatura, la maximización de biomasa, en condiciones experimentales anaeróbicas en cultivos continuos y aeróbicas en cultivos tipo lote. La función objetivo propuesta en este trabajo mejora las predicciones de crecimiento en un 10% y las predicciones de producción de etanol en un 75% respecto a las obtenidas por la función objetivo de maximización de biomasa, en condiciones anaeróbicas. En condiciones aeróbicas tipo lote la función objetivo propuesta mejora en un 98% las predicciones de crecimiento y en un 70% las predicciones de etanol con respecto a la función objetivo de biomasa.

Flux Balance Analysis - FBA - is one of the most used techniques in prediction of microorganism bioproducts. It requires an objective function that represents biological objective of the studied microorganism. This paper presents a new kind of objective functions based on individual physical compartment objetives in the studied microorganism. These kind of functions was tested with a stoichiometric model extracted from iMM904 reconstruction of S. cerevisiae and its performance is compared with the most used objective function in literature, growth maximization, in anaerobic and aerobic batch conditions. The presented objective function outperform growth predictions in 10% and ethanol predictions in 75% compared with obtained by maximization of growth objective function, in anaerobic conditions. In aerobic batch conditions the presented objective function outperforms in 98% growth preditions and 70% ethanol predictions compared with growth maximization.

Predicción a escala genómica de Componentes de Saccharomyces cerevisiae mediante Análisis de Balance de Flujos / Prediction of genome scale of Saccharomyces cerevisiae by flux balance analysis

El microorganismo Saccharomyces cerevisiae cuenta con gran número de modelos biológicos conocidos como reconstrucciones, las cuales pueden ser a escala genómica. De estas reconstrucciones a escala genómica provienen los modelos matemáticos, también llamados modelos estequiométricos. Una de las técnicas más usadas para estudiar estos modelos es el Análisis de Balance de Flujos (FBA). El proposito del FBA es predecir el crecimiento del microorganismo bajo estudio, y la producción y consumo de componentes como el etanol, CO2 glicerol, sucinato, acetato y piruvato. Para determinar si las predicciones obtenidas mediante FBA son únicas se utiliza la técnica de Análisis de Variabilidad Flujos (FVA). El presente trabajo muestra los resultados de aplicar el FBA a la reconstrucción reciente del microorganismo S. cerevisiae, la denominada iMM904 y los compara con un conjunto de datos experimentales presente en la literatura. Este trabajo también estudia la existencia de múltiples predicciones FBA utilizando la técnica FVA. Los resultados ilustran que es posible predecir el crecimiento del microorganimo S. cerevisiae, con errores entre el 11% y 28%; la producción de CO2, con errores entre el 0.3% y 4.5% y la producción de etanol, con errores entre el 11% y 13%.

Several biological models, named reconstructions, are used for the study of the S. cerevisiae microorganism. The reconstructions can be genomic scaled. Mathematical models are generated from the reconstructions and they are called stoichiometric models. The flux balance analysis (FBA) is one of the tools used for the analysis of these models. The FBA attempts to predict the evolution of the microorganism and the consumption and production of components like glucose, ethanol, glycerol, succinate, acetate and pyruvate. A Flux variability analysis (FVA) is used to determine the uniqueness of the FBA predictions. This paper shows the results of applying FBA to the iMM904 reconstruction of S. cerevisiae and compares them with experimental data from literature. The results in this paper show that it is possible to predict the evolution with errors between 11% and 28% ; the production of CO2 with errors between 0.3% and 4.5%; and the production of ethanol with errors between 11% and 13%, using FBA for the iMM904 model.

Implementación ee técnicas sencillas de remoció de proteínas mayoritarias de pplasma sanguíneo para análisis por electroforesis bidimensional (2d) / Implementatio off simple techniques for removal majority proteins from blood plasma and its posterior analysis by bi-dimensional (dd) / Electroporesis aaplicação de técnicas simples de remoçãode proteínas maajoritárias do plasma sanguíneo para sua posterior análise por eletroforese bidimensional (2d)

El plasma sanguíneo representa una de las muestras de mayor interés en el diagnóstico- pronóstico de diversas enfermedades. Sin embargo, constituye la muestra de mayor dificultad para establecer su proteoma, debido a la presencia de interferencias y proteínas abundantes que dificultan la detección de proteínas minoritarias. Con el objetivo de mejorar la resolución de las proteínas separadas por técnicas electroforéticas, se realizó una comparación de diferentes métodos de remoción de proteínas mayoritarias del plasma de pacientes con síndrome coronario agudo, usando técnicas de precipitación con sales y solventes orgánicos a diferentes concentraciones. La remoción de proteínas del plasma tratado mediante estas metodologías se verificó por análisis proteómicos usando electroforesis de proteínas (1D-y 2D-SDS-PAGE), análisis de imágenes y técnicas de bioinformática. El análisis mostró que metodologías sencillas como el tratamiento con acetona 75% (v/v) disminuyó la concentración de albúmina, retiró las interferencias que dificultan la detección de proteínas minoritarias, aumentando la intensidad de las manchas proteicas separadas mediante electroforesis 2D, y por consiguiente, mejorando la resolución y la detección de las proteínas separadas del plasma sanguíneo.

The blood plasma samples are one of the most interesting in the diagnosis, prognosis of various diseases. However, the sample is more difficult when setting its proteome, due to the presence of interference and abundant proteins that hinder the detection of minor proteins. To improve the resolution of proteins separated by electrophoretic techniques, we compare different methods of removal of major proteins in plasma of patients with acute coronary syndrome, by using techniques of precipitation with salts and organic solvents at different concentrations. Subsequently, the removal of plasma proteins treated by these methods was verified by proteomic analysis by using protein electrophoresis (1D-and 2D-SDS-PAGE), image analysis and bioinformatics techniques. The analysis showed that simple methods such as treatment with acetone 75% (v/v) decreased the concentration of albumin, removed the interferences that hinder the detection of minor proteins, increasing the intensity of protein spots separated by 2D electrophoresis, and improving the resolution and detection of separated proteins of blood plasma.

O plasma sanguíneo representa uma das amostras de maior interesse no diagnóstico- prognóstico de diversas doenças. No entanto, constitui a amostra de maior dificuldade no momento de estabelecer o seu proteôma devido ã s interferências e ã s proteínas abundantes que dificultam a detecção de proteínas minoritárias. A fim de melhorar a resolução de proteínas separadas por técnicas eletroforéticas, comparamse diferentes métodos de remoção de proteínas majoritárias do plasma de pacientes com síndrome coronária agudo, usando técnicas de precipitação com sais e solventes orgânicos em diferentes concentrações. Posteriormente, a remoção de proteínas do plasma tratado por meio destas metodologias foi verificada a través da análise proteômica usando eletroforese de proteínas (1D e 2D SDS-PAGE), análise de imagens e técnicas de bioinformática. A análise mostrou que metodologias simples como o tratamento com acetona 75% (v/v) diminuiu a concentração de albumina, retirou as interferências que dificultavam a detecção de proteínas minoritárias, aumentando a intensidade dos spots de proteínas separados por eletroforese 2D, e melhorando a resolução e detecção das proteínas separadas do plasma sanguíneo.

Estudio de la inserción de ADNk de Trypanosoma cruzi en el genoma de pacientes con enfermedad de Chagas / Study of Trypanosoma cruzi’s kDNA insertion into the genome of chagasic patients

La enfermedad de Chagas afecta cerca de 20 millones de personas y es una patología restringida al continente americano. Esta enfermedad de carácter crónico es causada por el parásito Trypanosoma cruzi del cual, en la actualidad se han definido dos poblaciones: Trypanosoma cruzi I y Trypanosoma cruzi II, con características particulares relacionadas con la distribución geográfica y el tipo de manifestaciones clínicas. Objetivo: Este estudio consistió en determinar si ocurre inserción del kDNA del Trypanosoma cruzi I en el genoma de pacientes chagásicos del área endémica de Santander (Colombia) a partir de muestras de ADN extraído de sangre periférica. Metodología: Se tuvieron en cuenta 130 muestras provenientes de pacientes sintomáticos, así como 50 muestras provenientes de pacientes asintomáticos, las cuales fueron analizadas mediante la técnica de PCR con los pares de cebadores Tcz1/Tcz2 y S35/S36 con el fin de identificar la presencia del parásito en dichas muestras. Posteriormente se tomaron las muestras que resultaron positivas de la PCR S35/S36, para realizar una doble digestión con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI, luego se realizó la separación de los fragmentos de ADN obtenidos en un gel de agarosa, y posteriormente fueron transferidos a una membrana de nylon e hibridados con un oligonucleótido sintético marcado enzimáticamente con digoxigenina. Conclusión: Ninguna de las muestras que se tuvieron en cuenta en este estudio hibridó con dicho oligonucleótido, es decir ninguna de estas muestras posee aquella secuencia del gen del parásito insertado en el genoma del paciente chagásico.

Chagas disease affects nearly 20 million people and it is a pathology restricted to the American continent. This disease has a chronic character and it is caused by the parasite Trypanosoma cruzi, which is actually classified in two major lineages: Trypanosoma cruzi I and Trypanosoma cruzi II. These lineages have particular features related with geographic distribution and clinical manifestations. Objective: This study consisted in determining if the kDNA of T. cruzi I is inserted into the genome of chagasic patients from the endemic area of Santander (Colombia), specifically in DNA extracted from samples of peripherical blood. Methodology: One hundred and thirty samples from symptomatic patients and 50 samples from asymptomatic patients were considered for this study; all of them were analyzed by PCR technique with primers Tcz1/Tcz2 and S35/S36 with the purpose of identifying the parasite’s presence in these samples. The samples that resulted positive of the PCR S35/S36 were double digested with EcoRI and BamHI restriction enzymes, the DNA fragments obtained were separated in an agarose gel, transferred to a nylon membrane and hybridized with a digoxigenin marked synthetic oligonucleotide. Conclusions: None of the samples of this study hybridized with this oligonucleotide, which means that none of them possess this parasite’s gene sequence inserted in the genome of the chagasic patient.

Efectos de la mttformina en el sindrome de ovaro poliquistico asociado a insullino resistencia

Se presenta la experiencia clínica del uso de metformina (1,7 g día), por 4 meses, en 11 pacientes con (SOP) asociado a resistencia insulínica. Se determinaron los efectos clínicos, bioquímicos y hormonales luego de 4 meses de terapia. Cinco de las pacientes que deseaban embarazo, continuaron recibiendo la droga, hasta por un año. Se evaluó durante el tratamiento los síntomas clínicos, historia menstrual, hirsutismo; y los niveles séricos de gonadotrofinas, andrógenos, globulina ligante sexual, insulina basal y postsobrecarga de glucosa, perfil lipídico y volumen ovárico. Siete de 11 mujeres (63,3%) restablecieron la ciclicidad menstrual. Tres pacientes lograron embarazo entre el 5º y 7º mes de tratamiento (60%) una de ellas presentó un aborto a las 8 semanas. No se observaron cambios en el hirsutismo índice de masa corporal y presión arterial. Hubo una disminución significativa de los niveles plasmáticos de insulina tanto basal como postsobrecarga; de la testosterona libre y un incremento de SHBG. No hubo cambios en los niveles de gonadotrofinas, dehidroepiandosterona sulfato (DHEAS) perfil lipídico ni del volumen ovárico promedio. La droga fue bien tolerada, y la consideramos como una alternativa útil en pacientes obesas con (SOP) con alteraciones menstruales y o infertilidad, asociada a hiperinsulinemia y resistencia insulínica.

We present the clinical experience with the use of metformyn (1.7 g per day) for four months in eleven patients with PCO associated with insulin resistance. We determinate the clinical effects, biochemical and hormonal changes during four month of therapy. Five of the patients, who wanted to get pregnant, continued receiving the drug for a year. We evaluated the clinical feelings menstrual history, hyrsutism and the levels of serum gonadotrophin, sex hormone-binding globulin (SHBG) basal insulin and postcharge glucose, lipid profile and ovarian volume. Seven of the eleven women (63.3%) start again the menstrual cycle. Three patients became pregnant between the fifth and seventh month (60%), one of them have an abortion at eight-week. We didn't find changes in hirsutism, corporal mass and arterial pressure. The result was a significat disminution in plasmatic levels of basal insulin and post overcharge, of free testosterone and one increase of the SHBG. No changes in gonadotrophins, DHEAS, lipid profile levels and the average ovarian volume were seen. The drug have a good tolerance and we consider it a good and useful alternative in patient with over, weight and with PCO, menstrual changes and infertility, associated with hiperinsulinism and insulin resistance.